数字PCR

数字PCR分析经历了三代技术的发展

数字PCR分析经历了三代技术的发展

从1985年至今的30多年时间里,PCR分析经历了三代技术的发展。第一代传统PCR技术,采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析。第二代荧光定量PCR技术,通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时检测PCR进程,最后用Cq值对基因进行定量分析。第三代数字PCR技术,通过将PCR反应液进行有限稀释,实现核酸分子的单分子扩增,最终采取终点法检测阳性微滴的荧光信号从1985年至今的30多年时间里,PCR分析经历了三代技术的发展。第一代传统PCR技术,采用琼脂糖凝胶电泳的方法对PCR产物进行定性分析。第二代荧光定量PCR技术,通过在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控PCR进程,最后用Cq值对基因进行定量分析。第三代数字PCR技术,通过将PCR反应液进行有限稀释,实现核酸分子的单分子扩增,最终采取终点法检测阳性微滴的荧光信号,有荧光信号的微滴判读为 1;没有荧光信号的微滴判读为 0,因此该技术被称为数字PCR,有荧光信号的微滴判读为 1;没有荧光信号的微滴判读为 0,因此该技术被称为数字PCR









原始样本浓度

在进行数字PCR检测之前需确认样本的原始浓度从而防止由于样本浓度过高出现所有微反应单元全阳信号或浓度过低出现所有微反应单元全阴信号导致统计学公式计算误差而形成检测结果的不精确一般来讲样本的原始浓度需在数字PCR的动力学检测范围内(大多为5个数量级)理想情况下当阴性分区为总分区数的20.3%时样本浓度最佳



















样本总体积

当数字PCR总分区数一定时样本的总加载体积同样会影响到最终的检测准确性比如关于稀有靶标的检测假设待测原始样本每5ul中含有1个拷贝的靶标分子假如只取5ul参加反响因为泊松散布的原理这个靶标分子很可能未被包含在5ul的原始样本中假如参加反响的样本体积增加到15ul就会大大提高待测样本中该靶标分子的检测概率然后提高检测结果的准确性和精确性

分区方法


数字PCR的分区方式主要为固相物理分割和 “油包水” 的液滴分区两种。


然而,泊松分布计算准确的前提是需要保证每个微反应单元体积大小一致。“油包水” 液滴生成的过程中,每个液滴的体积大小无法保证完全相同。液滴之间由于液体表面张力、操作不当等影响,导致其部分发生融合和破裂。融合使液滴体积变大,破裂则导致有效分区数量变少更增加了交叉污染的风险。


另外,还需注意微单元密闭与否。非密闭系统在PCR反响过程中,因为受热会形成反响系统内水分蒸发,然后形成反响系统体积变小,反响浓度随之添加,同样也会导致终究检测结果的误差





样本反应液总有效分区数


所谓有效分区数,通俗来讲是指最终生成含有反应液的可被计算到最终统计学公式中的微反应单元数。从刚才的介绍中我们已经知道,不同的分区方式会影响到最终有效分区数。另外,如何确定实际生成的有效分区数也很关键。泊松分布统计是根据有效分区数而非理论分区数来计算的。


操作误差


微反应单元制备的成功与否直接影响到最终数字PCR的结果。想要提高数字PCR结果的重复性及准确性,就要尽可能避免操作误差