数字PCR

数字PCR应用于HIV、HBV、HPV和HHV-6等病毒的定量检测

数字PCR应用于HIV、HBV、HPV和HHV-6等病毒的定量检测

导读检测灵敏度一直是病毒定量检测的首要关注点,微滴式数字PCR凭借出色的灵敏度、特异性、准确性和重复性,迅速应用于HIV、HBV、HPV和HHV-6等病毒的定量检测。经过科学合理的实验设计,微滴式数字PCR检测HHPV-6病毒的灵敏度可达到百万分之一,这为病毒治疗提供了强有力的帮助。


1.引物探针方案

HHPV6,设计一对引物和一条探针,FAM标记;

RPP30,人类基因组作为背景,设计一对引物和一条探针,HEX标记


2.检测样品方案

样品分为两份,第一份用于检测HHPV-6(HHPV-6浓度为0.025拷贝/微升,人的DNA浓度为25,000拷贝/微升);第二份用于检测人的RPP30基因(将25,000拷贝/微升的人DNA稀释25倍,人的DNA浓度为1,000拷贝/微升)。


两份样品的检测结果乘上稀释的倍数,然后进行比较就可以得到病毒的含量。

3.HHPV-6检测方案

4孔-阳性对照:将HHPV-6和人的DNA按已知浓度混好;

8孔-NTC对照:不加DNA模板的对照;

60孔-阴性对照:只有人的DNA,浓度为25,000拷贝/微升;

24孔-HHPV-6样品:HHPV-6(终浓度为0.025拷贝/微升)加入到人的DNA(浓度为25,000拷贝/微升)。


 4.实验结果与讨论上述实验检测结果如下表,由表可见,数字PCR仪成功检测到含量低至百万分之一的HHPV-6病毒,定量结果与理论值非常吻合。 对于这种稀有核酸样品进行检测时,必须有足够多的阴性对照孔来确保阳性判读的准确性。阴性对照中的假阳性微滴主要来源有:样品污染,引物探针设计不合适,仪器原因等。对于微滴式数字PCR,污染的主要来源于微滴形成之前,微滴形成之后则不存在污染的问题。稀有突变检测的灵敏度依赖于引物探针的特异性,以及实验操作的规范程度,针对不同的Assay需要分别进行试验和探索。