PCR

数字PCR发展

数字PCR发展

数字PCR发展


  PCR(数字PCRdPCR)是近年来发展起来的一项突破性的定量分析技术。1990年,耶鲁大学医学院的Claibome  Stephens应用单分子稀释(SMD) PCR和泊松统计研究单倍体DNA。1992年,赛克斯等人利用样品的有限稀释在每个孔中仅获得一个模板分子,并计算出PCR后的扩增信号,以便准确确定起始分子的数量。虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但已经确立了数字PCR的基本实验过程,确定了数字PCR检测中一个极其重要的原理:“终点信号的有无”这就是数字PCR的雏形。


  1999年,Vogelstein等人在检测粪便中癌组织的游离细胞中的BRAF特异性突变基因时,由于体细胞基因的干扰,遇到了检测灵敏度和分辨率的瓶颈。他们采用了在384孔板中限制每个反应孔的样品量和增加检测反应孔数量的方法,从而提出了数字聚合酶链反应的概念,并提出如果使用更多的孔板,检测灵敏度会更高,从而指出了数字聚合酶链反应系统的发展方向。


  数字聚合酶链反应原理


  液滴生成后,标准的PCR反应体系被分配到约3万个液滴中,每个液滴含有或不含有一个或多个拷贝的靶分子(DNA模板),从而实现“单分子模板PCR扩增”。扩增后,含有核酸分子模板的液滴会发出荧光信号。最后,根据泊松分布原理和阳性液滴的比例,分析软件可以计算出目标分子的浓度或拷贝数。


  数字PCR可以直接计算目标序列的拷贝数,因此可以进行准确的绝对定量检测,而不依赖于对照样品和标准曲线;另外,由于数字PCR在解读结果时只判断是否存在两种扩增状态,因此不需要检测荧光信号与设定阈值线的交点,完全不依赖于ct值的识别。因此,数字聚合酶链反应的反应受扩增效率的影响很大,对聚合酶链反应抑制剂的耐受性也大大提高;在数字聚合酶链反应实验中,标准反应体系的分布过程可以大大降低与目标序列竞争的背景序列的浓度。


  数字聚合酶链反应的应用领域


  医药:肿瘤研究;传染病研究(细菌、真菌、病毒、支原体);NIPT;器官移植监测;干细胞研究和移植监测;药物基因组学的发展;生物标志物开发;药品生产的质量控制等。食品安全:病原微生物检测、食品过敏原、微量检测、转基因转基因。


  环境监测和宏基因组研究。


  引用


  1、数字聚合酶链反应。美国科学院,第96卷,第9236-9241页,1999年8月遗传学。


  2、实时聚合酶链反应,桑德斯纳,方法摩尔生物。2004;266:191-211.