利用双色荧光互相关谱技术定量纳米尺度下的液-液相分离过程

2020年10月21日，清华大学生命科学院陈春来课题组和李丕龙课题组合作在《美国科学院院报》（PNAS）杂志发表了题为“利用双色荧光互相关谱技术定量纳米尺度下的液-液相分离过程”（Phase separation at the nanoscale quantified by dcFCCS）的文章。

相变作为物质的一种特性（如水、冰和水蒸气三相之间的转换）在物理学界及日常生活中早已广为人知。虽然相变是一个物理现象，但是近年的研究表明相变在生命活动中同样发挥着至关重要的作用。在细胞中，相变是以生物大分子（蛋白质和RNA）液-液相分离（Liquid-liquid phase separation，LLPS）的形式发生的，类似的现象在高分子化学和软物质物理等领域的研究已经有近百年的历史了。细胞中存在“液-液相分离”现象是在2009年被明确提出，并成为近几年来生命科学领域的一个新兴热点。近期的研究表明，液-液相分离可能诱导细胞内形成多种没有脂膜包被的无膜细胞器。这些无膜细胞器通过对细胞组分的选择性浓缩和分离，参与了包括RNA代谢，核糖体生成，DNA损伤应答和信号转导等许多过程。此外，液-液相分离过程与神经退行性疾病、衰老等有着密切的关系。

目前主要是利用相差、宽场和共聚焦荧光显微镜来观测液液相分离过程的发生、形貌和动态变化。为了突破常规成像技术中光学衍射极限（~200 nm）的限制，超分辨成像技术也被用于捕捉液滴相的形成、运动和相变体中的纳米微结构。迄今为止，仍然缺乏合适的技术在纳米尺度上定量捕捉液滴相的出现、增长速率、组成分子的化学计量比、与被招募分子的结合常数等重要的物理和化学参数。

为解决液-液相分离领域的以上技术空白，研究者发展了基于双色荧光互相关谱（dual-color fluorescence cross-correlation SPEctroscopy，dcFCCS）的新型相分离表征手段，并利用此技术定量地表征基于Saccharomyces cerevisiae SmF（ySMF）蛋白的模型相变体系在1 nM到500 nM这一广泛的浓度区间内的寡聚体和液滴相的尺寸、增长速率、分子组成和与被招募分子的亲和力。结果表明，液-液相分离可在光学衍射极限以下的纳米尺度发生，且他们实验中所捕捉到的最小的液滴相半径为20纳米左右。此外，液滴相的形成及其大小并不影响被招募分子与液滴相的骨架分子之间的结合能力；这表明在热力学平衡态下，纳米和微米尺度的液滴相有着相同的选择性浓缩和分离能力。在测量结果的基础上，他们还构建了蒙特卡洛模拟模型，用以描述溶液中单分散状态的分子逐渐聚集形成纳米尺度的液滴相的动态过程。结合模拟结果和对dcFCCS定量数据的二维聚类分析，他们标定了在纳米尺度发生液-液相分离过程的临界浓度，比常规共聚焦显微镜的测量极限还要低近一个数量级。最后，研究者推测，由于纳米尺度的液滴相的形成和消失速度比微米尺度的更快，因而纳米尺度的相分离过程可能在快速调控和信号响应等过程中发挥着重要的生理功能。双色荧光互相关谱（dcFCCS）将成为定量表征相分离过程和揭示其功能的重要技术手段。

清华大学生命科学学院陈春来研究员和李丕龙研究员为本文共同通讯作者。清华大学生命学院15级博士生彭思佳、16级博士生李维平和17级博士生姚溢融为共同第一作者，PTN项目18级博士生邢文婧参与了研究。本工作获得了国家自然科学基金委、北京结构生物学高精尖创新中心、北京生物结构前沿研究中心及清华-北大生命科学联合中心的经费支持。